Kit de PCR en tiempo real del virus de la viruela del simio

1. muestraRecopilación:La muestra debe recogerse en tubos estériles de acuerdo

con especificaciones técnicas estándar.

2. Preparación de reactivos (área de preparación de reactivos)

Saque los componentes del kit, equilibrelos a temperatura ambiente para usarlos en espera.

3. Procesamiento de muestras (Área de procesamiento de muestras)

3.1 Extracción de ácido nucleico

Se recomienda tomar muestras líquidas de 200μL, Control Positivo y Control Negativo para la extracción de ácidos nucleicos, según los requisitos y procedimientos correspondientes de los kits de extracción de ADN viral.

3.2 Disolución del polvo liofilizado y adición de plantilla

Prepare la premezcla liofilizada del virus de la viruela del mono según el número de muestras.Una muestra necesita un tubo de PCR que contenga premezcla en polvo liofilizada.El control negativo y el control positivo deben tratarse como dos muestras.

(1) Agregue 15 μl de solución disolvente en cada tubo de PCR que contenga premezcla liofilizada, luego agregue 5 μl de muestras extraídas/control negativo/control positivo en cada tubo de PCR respectivamente.

(2) Cubra bien los tubos de PCR, mueva los tubos de PCR con la mano hasta que el polvo liofilizado esté completamente disuelto y mezclado, recoja el líquido en el fondo de los tubos de PCR mediante centrifugación instantánea a baja velocidad.

(3) Si utiliza un instrumento de PCR en tiempo real común para la detección, transfiera directamente los tubos de PCR al área de amplificación;Si utiliza BTK-8 para la detección, deberá realizar las siguientes operaciones: transferir 10 μL de líquido del tubo de PCR al pocillo del chip de reacción de BTK-8.Un tubo de PCR corresponde a un pocillo del chip.Durante la operación de pipeteo, asegúrese de que la pipeta esté a 90 grados vertical.Las puntas de las pipetas con barrera de aerosol deben colocarse en el centro del pocillo con fuerza moderada y dejar de empujar la pipeta cuando llegue a la primera marcha (para evitar burbujas).Una vez llenos los pocillos, retire una membrana del chip de reacción para cubrir todos los pocillos y luego el chip se transfiere al área de detección de amplificación.

4. Amplificación por PCR (área de detección)

4.1 Coloque los tubos de PCR/chip de reacción en el tanque de reacción y establezca los nombres de cada pocillo de reacción en el orden correspondiente.

4.2 Configuraciones de detección de fluorescencia: (1) Virus de la viruela del simio (FAM);(2) Control Interno (CY5).

4.3 Ejecute el siguiente protocolo de ciclismo

Protocolo de ABI7500, Bio-Rad CFX96, SLAN-96S, QuantStudio:

 Protocolo de BTK-8:

5. Análisis de resultados (consulte el Manual del usuario del instrumento)

Después de la reacción, los resultados se guardarán automáticamente.Haga clic en "Analizar" para analizar y el instrumento interpretará automáticamente los valores Ct de cada muestra en la columna de resultados.Los resultados de los controles negativos y positivos se ajustarán a lo siguiente "6. Control de calidad".

6. Control de calidad

6.1 Control Negativo: Sin Ct o Ct>40 en el canal FAM, Ct≤40 en el canal CY5 con curva de amplificación normal.

6.2 Control Positivo: Ct≤35 en canal FAM con curva de amplificación normal, Ct≤40 en canal CY5 con curva de amplificación normal.

6.3 El resultado es válido si se cumplen todos los criterios anteriores.De lo contrario, el resultado no es válido.

Interpretación de resultados

Los siguientes resultados son posibles:

NOTA: Si se produce un resultado no válido, es necesario recolectar y analizar la muestra nuevamente.